并吡咯喹咯喹定吡的含咪唑啉醌啉量中法测

吡咯喹啉醌(pyrroloquinolinequinone，法测PQQ)是定吡的含一种不同于烟酰胺核苷酸(NAD⁺和NADP⁺)和黄素核苷酸(FAD和FMN)的新有机辅酶，上世纪60年代在研究非磷酸化细菌的咯喹咯喹葡萄糖代谢过程中被首次发现。从微生物到人体组织，啉醌啉I量PQQ在自然界的咪唑分布范围极广。动物和人类通过饮食途径获取PQQ以满足机体需要。并吡PQQ具有极其独特的法测理化性质，其促生长、定吡的含抗应激和在动植物发育繁殖方面的咯喹咯喹营养作用越来越受到重视。目前对于PQQ主成分的啉醌啉I量含量测定方法较多，但测定PQQ中杂质的咪唑方法鲜有报道，本文通过实验研究建立了HPLC法测定PQQ中咪唑并吡咯喹啉(IPQ)杂质含量的并吡方法。

一、法测材料与方法

1、定吡的含仪器与材料

Agilent1260型高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；METTLER-TOLEDOXS205DU型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；乙腈(上海星可高纯试剂有限公司)；磷酸氢二钾(国药集团化学试剂有限公司)；四丁基溴化铵(阿拉丁)；磷酸(ScharlabS.L)；PQQ及IPQ对照品为自制；PQQ样品为自制(批号为17901、咯喹咯喹17902、17903)。

2、色谱条件

TCIKaseisorbLCODS2000色谱柱(4.6mm×150mm，5lxm)；流动相为乙腈-缓冲溶液(配制10mmol的磷酸氢二钾和15mmol的四丁基溴化铵水溶液，用磷酸调节pH至7.4)[28:72]；紫外检测器，检测波长为259nm；流速为1.0mL／min；进样量为20μL。

3、溶液配制

对照品溶液：精密称取PQQ对照品适量，用稀释剂(乙腈-水=[1:3])定量稀释制成每lmL中约PQQ 0.1μg的溶液。供试品溶液：精密称取PQQ样品适量，用稀释剂定量稀释制成每lmL中约PQQ 0.1mg的溶液。

4、检测方法

取对照品溶液与供试品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积按外标法计算供试品中IPQ的含量。

二、结果与讨论

1、专属性试验

取空白溶液、对照品溶液和混合溶液进样并记录色谱图，并用tPQ对照品溶液进行定位；确定出峰顺序与分离度，PQQ于IPQ之间的分离度为3.1，大于1.5，空白溶液无干扰。空白溶液图谱见图1，对照品溶液图谱见图2，混合溶液图谱见图3。

2、检测灵敏度试验

精密称取IPQ对照品适量，用稀释剂溶解并逐级定量稀释，测试IPQ峰的信噪比，确定检测限和定量限，试验结果见表1，检测限图谱见图4，定量限图谱见图5。拟定PQQ中IPQ的限度为不大于0.1％，本文综合检测限与定量限的结果选择0.05％为报告水平。
 

3、精密度试验

0.10％和0.15％水平加入IPQ，每个浓度依法平取同一对照品溶液，连续进样6次，记录色谱图，结果对照品溶液种主峰面积的RSD为1.4％，表明仪器精密度良好。取同一批样品，依法平行操作制备6份供试品溶液，分别测定，结果均未检出IeQ。取同一批样品，分别在0.05％、0.10％和0.15％水平加入IPQ，每个浓度依法平行操作制备3份加标溶液，分别测定，结果9份加样回收率的RSD为3.2％，表明方法重复性良好。不同分析员使用不同的仪器对同一批样品进行测定，结果一致，表明方法中间精密度良好。

4、标准曲线的绘制和线性关系的考察

配制IPQ浓度分别为0.05、0.08、0.1、0.15、0.2μg／mL的溶液，分别进样并记录色谱图，以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标进行线性回归，计算线性方程和相关系数，得到线性方程为Y=77.7168X+0.042976，线性相关系数为0.99976，结果表明IPQ在线性范围内与峰面积呈良好的线性关系。

5、加样回收率试验

分别在供试品中加入规定浓度的0.05％、0.10％和0.15％水平的IPQ，依法处理并测定，计算加样回收率，结果见表2。结果表明该方法具有较好的准确度。

6、溶液稳定性试验

配制对照品溶液和供试品溶液，分别室温放置12h、24h、36h后进样检测，放置后与0h检测结果相比，对照品溶液PQQ峰面积变化均不大于4.0％，供试品溶液测定结果一致，表明溶液在36h内稳定。

7、耐用性试验

分别改变测试条件，如改变流动相中有机相的比例、流动相中缓冲溶液的pH、柱温及流速，依法测定，结果与标准条件下测定结果一致，表明本方法具有良好的耐用性。

8、样品含量测定

取PQQ样品，依法测定，结果均未检出IPQ，表明产品均符合拟定质量指标要求，具体见表3。

在方法建立过程中，考虑到IPQ杂质相对于PQQ产品的制备成本会高很多，对IPQ相对于PQQ的相对响应因子(RRF)进行了测试，结果为1.089，介于0.9～1.1之间，因此采用PQQ作为外标法计算的对照品，大大减少了IPQ杂质对照品的用量。

三、结论

方法学验证表明，建立的HPLC法测定PQQ中IPQ含量的方法，具有良好的专属性、检测灵敏度、精密度、线性和准确度，方法较为简便，准确可靠，能够比较好地控制产品质量，易于推广应用，适用于PQQ中IPQ的质量控制。

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